高中生侦探工藤新一和青梅竹马毛利兰去游乐园玩时，目击了黑衣男子的可疑交易现场。新一因只顾偷看交易而被另一名同伙灌下毒药，醒来后身体缩小。为保性命及身边人安全，在阿笠博士建议下，他化名江户川柯南，寄住在父亲是侦探的小兰家中，以搜集黑衣组织情报。灰原哀本名宫野志保，原为黑衣组织的科学家，因反抗组织被囚禁，后服下和新一相同的毒药身体缩小逃脱，化名灰原哀。在与黑暗组织的对抗中，出现了神秘女子伊藤希芸子化名的宫本兰西。她表面是黑暗组织成员，代号“蒂塔”，在组织里地位较高，实际是NSA的卧底。其父亲是FBI官员，母亲是翻译官，精通多种语言。宫本兰西凭借聪明才智和特殊身份，在黑暗组织中小心翼翼搜集情报，试图找到组织核心秘密并将其摧毁。江户川柯南在不断侦破案件过程中，逐渐察觉宫本兰西的不寻常。安室透，本名降谷零，日本公安警察派入黑衣组织的卧底，代号“波本”，也注意到宫本兰西的异常举动。经过一番暗中较量和试探，安室透和宫本兰西发现彼此都是卧底，于是决定合作。